黑夜降临在位于华盛顿特区的史密森尼研究中心（Smithsonian Institution），旅行团向导已经回家，灯已经熄灭，学校的孩子们都乖乖上床睡了…，但前夜间警卫赖瑞（班史提勒Ben Stiller饰演）却发现不可思议的一切正悄悄上演，赖瑞发现自己掉入了一场最大、最震撼想象力的冒险旅程，但这一切并非虚构，而是历史正活了过来。在《博物馆奇妙夜》第二集中，在这个世界上最大博物馆的一角，赖瑞亲身参与了一场史诗战役。现在，在史密森尼即将翻天覆地的大混乱底，赖瑞要把他之前那些要好的伙伴们给救出来，因为此刻，就连挂在墙上那些世界名画，突然都有了意志，一场大战即将展开。